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科普 | 环介导等温扩增微流控检测技术
2023-09-15    作者: 小编

基于微流控芯片的核酸扩增检测系统是微流控技术最具前景的应用方向之一,它简化了核酸扩增检测中繁琐的样品前处理和扩增产物检测步骤。在多种检测方法当中,环介导等温扩增技术(LAMP)微流控检测技术结合的核酸扩增检测系统非常适合于应用于POCT(床边检测)。根据国内外相关研究报道,环介导等温扩增微流控技术已经应用于检测病原微生物、癌症生物标志物以及其他标志物检测领域。

 

 

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)是2000年由日本荣研株式会社的Notomi等人提出的一种新型核酸扩增技术。该技术依靠4-6条特异性引物和一种具有链置换活性的 DNA 聚合酶(Bst DNA聚合酶),在等温条件(60-65℃)下扩增靶序列,避免的传统PCR需要变温扩增而对精密仪器的依赖性,同时具有快速、高效、特异性强的特点。

 

 

环介导等温扩增具有操作简便、快捷、高效、特异性等特点,能满足微流控集成诊断系统的要求,实现两种技术的完美结合。同时微流控技术也可以为LAMP核酸检测系统提供形状、大小不同的微量密闭反应通道及微反应空间,有效克服了LAMP易产生气溶胶,造成实验污染的弊端。微流控技术可提供平行且互不干扰地微反应区,可以构成多通道环介导等温扩增诊断集成系统。

 

 

 

周杰等采用北京博奥晶典生物技术有限公司RTisochip-A 恒温扩增微流控芯片分析仪,基于环介导恒温扩增技术对转基因农作物样品中靶标基因进行检测。该碟式芯片共有24个样品检测孔,每个孔体积为2.2uL。检测时间为30min,该检测试剂可以大大缩短检测时间和降低检测成本。

 

 

Abkar Ahmed Sayad 等开发出一种碟式离心型微流控装置。该装置分为三层,底部PMMA层,中间压敏胶(PSA)粘合层和底部PMMA层。微流控通道通过切刻机在底层制作出混合试剂、测量、 等温扩增和检测的微流控腔室。LAMP 实验的排气和装载孔、蜡、密封材料放在微流控 CD 顶层。该系统,对添加沙门氏菌的番茄进行检测,检出限为 5×10-3 ng/uL。整个过程,从样品制备到检测,可以70min内在微流控 CD 上全自动化完成。

 

 

Zhou等运用碟式离心聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片荧光 LAMP 检测法,成功实现了一类弧菌的芯片 LAMP 快速检测,检测时间仅用30min,芯片LAMP扩增较之常规LAMP扩增,具有操作简便,扩增速度快,便于携带,实时快速等优点,相对于常规LAMP 检测法耗材量大大降低。

 

 

美国Rheonix公司开发的基于微流控技术的 CARD 芯片,该芯片集成泵、阀门、微通道、反应和试剂储液池,以及通用DNA阵列。CARD芯片采用聚苯乙烯均聚物注塑而成,可以用于免疫检测和核酸检测。Chen 等可在60min内,使用 CARD 芯片提取人类免疫缺陷病毒(HIV)RNA ,20min内完成进行 RT-LAMP 检测,分析灵敏度可达每毫升 103 病毒颗粒(103vp/mL)。此外,台式 RT-LAMP 和 CARD 芯片上的分析结果显示加入病毒与结果CT值的一致性,说明CARD芯片具有与劳动密集型的台式LAMP同样的处理能力。

 

 

Dou等研发了一种PDMS-纸混合微流控装置,PDMS不用复杂的表面处理,无大型设备,将“纸”的技术引入到微流控LAMP装置中。该装置包括三层,两个PDMS层和一个玻璃载片底层。首层PDMS用于试剂递送,包含三个微通道和一个加样入口。中间PDMS层由底部的6个孔道组成,作为LAMP反应区。底层为用于支撑的玻璃载片。该装置可以在45min内检测最低为3个拷贝的脑膜炎奈瑟氏球菌。

 

 

Coelho等设计了一种T型数字微流控芯片,使用数字微流控与LAMP结合的技术扩增癌基因c-myc 0.5 ng/uL靶标DNA只需45min,反应液仅需1.54ul,远远低于台式反应技术。

 

 

Wan等为了进一步加强LAMP反应的特异性,开发了一种使用分子信使DNA探针的病原体数值微流控系统。该系统仅需1uL的LAMP反应样品。可以在40min内检测最低10个拷贝。该检测速度比传统商品定量PCR设备的快3倍。并且有效解决LAMP假阳性问题,区分特异性反应产物和非特异性反应产物。

 

 

Song等研制了一种简单易于操作,价格低廉,POCT集成式,RT-LAMP微流控芯片装置,可用于寨卡病毒检测。该装置在杯盖抽屉内集成了镁-铁反应的热源,来控制LAMP反应温度。一次性微流控芯片完成病毒核酸的捕获、浓缩、提纯、等温扩增和检测。扩增产物的检测不需要额外的仪器,采用无色结晶紫染料进行目测。整个装置可以在40min内完成口腔样本中寨卡病毒灵敏度5个单位。

本文介绍了四种类型的LAMP微流控检测技术,虽然微流控结构大不相同,但是均集成了LAMP技术和微流控技术的优势,特异性强、灵敏度高、样品消耗少、节省时间、检测高效和操作简便。应用领域涉及,疾病监测和管理、病原体鉴定、环境监测、流行病学调查及遗传病的检测。因此,相信随着这项技术的不断完善,不久将来,LAMP微流控检测技术的产品会相继进入市场,为人类生命健康发展和生态环境保护起到重要的推进作用。